Next Generation Sequencing 系列: SOLiD 系統

Applied Biosystems 的SOLiD 算是NGS技術平台中聲音比較小的,他沒有Solexa 高通量的優勢,也不像 GS FLX 有長度的優勢,在以力服人的定序界,他賣相不是那麼特出。但他有些不能忽視的強項,還是值得要介紹一下,我們先來看一下影片:
##ReadMore##SOLiD 的放大及分離方式是emPCR,反應後的珠珠固定玻璃載體上,然後進行序列的讀取,參見下圖:圖片引用自(這裡)

他讀取訊號的方法很特別,是使用接合的方式,我不確定為什麼 SOLiD會使用這麼複雜的方式,是基於專利迴避還是為了提昇準確度,Anyway, 讓我們花一點時間解釋:
1. 使用unversal primer 1 開始,然後第一個 diBase (AT) probe 以ligase 接上,probe 依前兩個base, 標上螢光(右上角所示).
2. 讀取螢光訊號
3. phosphotase 除去沒有成功ligation的fragemnt, 讓他們在之後的反應,永遠閉嘴
4. 切掉末端螢光(所以現在probe 還剩下前兩個AT及三個留下來的base)
5. 然後重複 1-4 的步驟
6. 把由universal primer1串接的片段,洗掉,再用 universal primer 2 再來一次 1-5,primer2 的起始位置較primer1, 向後一格,所以diBase probe的配對組合就不同了。
7. diProbe 每次接上去 5 bp, 所以用 5 個 primer set, 就可以唸到每一個base,

8. 最後的結果就像表格所畫的那樣,請注意看喔!每一base(欄)都有會被兩個diProbe唸到,例如base no.1 會被primer 1,2 讀到,base no.2 是primer 1,5.

接下來說解碼,雖然diProbe 共有 4 x 4 種組合,但是一共只用了4種螢光,所以有四種DiProbe是發同一種螢光,這不會搞混嗎?

巧妙的地方就在那這裡了,回想一下上圖的8,diProbe會交叉頭尾,那如果我們知到1st Code是AT,那麼第二個Code一個是T?,那就不是4x4 而是1x4,那用四種螢光就可唸出來了.

那麼第一個Code怎麼辦?紅色有AT, CG, GC,TA 四種組合,我們怎麼知道那一個?

這個隱藏關卡在primer 2, 有沒有注意到 primer 2倒退了一個,所以第一個base 是unversal primer 的最後一個base, 這個序列我們知道,那所有的問題就全解決了。 還看不懂嗎?

呵,請參見下圖


SOLiD 獨殊的讀取方式,讓他每個鹼基都經過兩次的確認,因而大幅提高了正確率,這在再定序及SNP有很重要的意義,因為這些應用上,要看的差異常在一個鹼基上,正確率的價值無可取代,另外反應的耗材成本而言,其實SOLiD的單位成本是目前三種系統中最低的,如果你的實驗目的是再定序或SNP,SOLID是非常好的選擇。 但他的缺點是因為獨特讀取方式,所以單一READ的長度是三種平台中最短的50bp,並且似乎也不像其他系統有積極增長的企圖,這個長度對無參考序列的基因體組合是很大的問題。我個人猜測ABI 並不是不明白這個弱點,只因為天生限制,既然如此就不必以己之短攻人之長,專注在再定序的市場就好,至於全基因體定序,現有的平台都不夠好,不如壓注下一階段的定序技術。

有關SOLiD 的技術,很草率的介紹完了,並不是看不起它,而是Lucas 最近體悟到了現今的NGS還沒有到可用的階段,真正的主角還沒登場,所以就有點意態闌珊了,有機會再來跟大家聊聊Lucas 對NGS 的想法。


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留言

  1. 這邊在小小補充一下
    SOLiD 的長度還可以用在 small RNA, 剛剛好!!
    而且單就reads number來說, 在差不多的價位底下,SOLiD是最多的。
    如果對實驗的depth較感興趣的話,倒也是個不錯的選擇,
    看這三個平台就像是看三國一樣, 還滿精彩的!!

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